1、 標本的采取和保存

 

可用作 ELISA 測定的標本十分廣泛，體液(如血清)、分泌物(唾液)和排泄物(如尿液、糞便)等均可作標本以測定其中某種抗體或抗原成份。有些標本可直接進行測定(如血清、尿液)，有些則需經預處理(如糞便和某些分泌物)。大部分ELISA 檢測均以血清為標本。血漿中除尚含有纖維蛋白原和抗凝劑外，其他成份均同等于血清。制備血漿標本需借助于抗凝劑，而血清標本只要待血清自然凝固、收縮后即可取得。除特殊情況外，在醫學檢驗中均以血清作為檢測標本。在ELISA 中血漿和血清可同等應用。

 

血清標本可按常規方法采集，應注意避免溶血，紅細胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質，以HRP 為標記的ELISA 測定中，溶血標本可能會增加非特異性顯色。

 

2 試劑的準備

 

按ELISA試劑盒說明書的要求準備實驗中需用的試劑。 ELISA 中用的蒸餾水或去離子水，包括用于洗滌的，應為新鮮的和高質量的。自配的緩沖液應用pH 計測量較正。從冰箱中取出的試驗用試劑應待溫度與室溫平衡后使用。試劑盒中本次試驗不需用的部分應及時放回冰箱保存。

 

3 加樣

 

在 ELISA 中一般有3 次加樣步聚，即加標本，加酶結合物，加底物。加樣時應將所加物加在LEISA 板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產生氣泡。

 

加標本一般用微量加樣器，按規定的量加入板孔中。每次加標本應更換吸嘴，以免發生交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加樣。有此測定(如間接法 ELISA )需用稀釋的血清，可在試管中按規定的稀釋度稀釋后再加樣。也可在板孔中加入稀釋液，再在其中加入血清標本，然后在微型震蕩器上震蕩1 分鐘以保證混和。加酶結合物應用液和底物應用液時可用定量多道加液器，使加液過程迅速完成。

 

4 保溫

 

在 ELISA 中一般有兩次抗原抗體反應，即加標本和加酶結合物后。抗原抗體反應的完成需要有一定的溫度和時間，這一保溫過程稱為溫育(incubation) ，有人稱之為孵育，在ELISA 中似不恰當。

 

ELISA 屬固相免疫測定，抗原、抗體的結合只在固相表面上發生。以抗體包被的夾心法為例，加入板孔中的標本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結合的機會，只有貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個逐步平衡的過程，因此需經擴散才能達到反應的終點。在其后加入的酶標記抗體與固相抗原的結合也同樣如此。這就是為什么ELISA 反應總是需要一定時間的溫育。溫育常采用的溫度有 43℃、37℃、室溫和4℃(冰箱溫度)等。37℃是實驗室中常用的保溫溫度，也是大多數抗原抗體結合的合適溫度。在建立ELISA 方法作反應動力學研究時，實驗表明，兩次抗原抗體反應一般在37℃經1-2 小時，產物的生成可達。為加速反應，可提高反應的溫度，有些試驗在43℃進行，但不宜采用更高的溫度。抗原抗體反應4℃更為*，在放射免疫測定中多使反應在冰箱中過夜，以形成多的沉淀。但因所需時間太長，在ELISA 中一般不予采用。