褪黑激素ELISA Kit
（德國IBL：RE54021）
1、應用范圍
此試劑盒可用于人血清和血漿中褪黑激素的體外定量檢測。
2、前言說明
松果體因其在光周期現象中的重要作用，已經被人們認為是神經內分泌的傳感器。松果體主要分泌的激素是：N-乙酰-5-甲氧色胺和褪黑激素，褪黑激素一般是由色氨酸合成而來的。血漿褪黑激素的濃度可在夜間達到zui高。褪黑激素*的波動變化可以反映出一些關于時間變化的信息，如夜晚的長短。褪黑激素的分泌會受到神經系統的調節。交感神經系統在調節褪黑激素分泌方面發揮有重要作用，它主要是通過釋放去甲腎上腺素來調節的。據報道，褪黑激素分泌方式和水平的變化與人的一些生理狀態一致，如：失眠、時差感、情緒低落、壓力大、精神分裂癥、丘腦下部性閉經、妊娠、神經想食欲缺乏、某些癌癥、免疫系統紊亂和青春期性成熟的影響。大多數循環褪黑激素都可在肝內代謝成6-羥基褪黑激素，之后變成6-硫酸褪黑激素而隨尿液排除。尿液中6-羥基褪黑激素硫酸鹽的濃度與血液中褪黑激素的總水平有很好的相關性。
3、實驗原理
此ELISA試劑盒利用的是競爭法的原理。生物素和非生物素標記的抗原競爭性結合包被板上有限的抗體結合位點。生物素抗原結合到抗體上的量與樣品中抗原的量成反比。系統達到平衡后，洗板除去游離的生物素抗原，結合到抗體上的生物素抗原可以用抗生物素堿性磷酸酶標記物和對硝基苯磷酸底物檢測出來。用已知的標準品數據做一條標準曲線，將未知樣品的酶活性與標準曲線進行比較就可以定量出未知樣品的量。
4、儲存與穩定性
試劑盒必須在2-8℃的環境下運輸和儲存，避免太陽直射。樣品的儲存與穩定性及試劑準備將在相關章節中闡述,如果將包被板密封并儲存于2-8℃的環境下時,試劑在有效期內穩定。用甲醇洗提后的提取柱可用于其它樣品的提取或儲存于2-8℃的環境下。提取柱可重復使用4次。
5、樣品的采集與儲存
血清，血漿（EDTA，肝素）
| 按照靜脈穿刺的常規注意事項采集樣品，血液樣品自采集到實驗時都必須保證其化學完整性。不要使用明顯溶血、黃疸和脂血樣品。混濁的樣品應當在實驗開始前離心以除去所有的顆粒性物質。 | ||||
| 儲存 | 2-8℃ | ≤-20℃ | ≤-70℃ | 避免太陽直射，避免反復凍融。 |
| 穩定性 | 24小時 | 3個月 | 1年 | |
6、試劑盒成分
| 數量 | 標記 | 成分 |
| 1×12×8 | MTP | 包被板，可拆，微孔中包被了抗兔IgG（羊，多克隆）。 |
| 3×2ml | BIOTIN LYO | 褪黑激素生物素，凍干，內含穩定劑。 |
| 3×2ml | ANTISERUM LYO | 褪黑激素硫酸鹽抗血清， 凍干粉，內含抗血清（兔，多克隆）和穩定劑。 |
| 1×250ul | ENZCONJ CONC | 酶聯物，80倍濃縮，內含堿性磷酸酶標記的抗生物素抗體（羊）、Tris緩沖液和穩定劑。 |
| 1×6×2ml | CAL A-F LYO | 標準品A-F，凍干粉，內含穩定劑，提取濃度請見試劑瓶標簽或QC質控品。 |
| 1×2×2ml | CONTROL 1+2 LYO | 質控品1+2，凍干粉，內含穩定劑，濃度/可接受范圍請見試劑瓶標簽。 |
| 1×50ml | ASSAYBUF CONC | 檢測緩沖液，10倍濃縮，內含磷酸緩沖液、吐溫和穩定劑。 |
| 1×9× | PNPP SUBS | PNPP底物片，密封于鋁鉑金屬袋中，內含對硝基苯硫酸鹽。 |
| 1×27ml | PNPP BUF | PNPP底物緩沖液，即用，內含二乙醇氨和水。 |
| 1×15ml | PNPP STOP | PNPP終止液，即用，內含1M的NaOH和0.25M的EDTA。 |
| 2×10 | EXTRCOL | 提取柱，即用，C18 RP，1m3/100mg。另需提取柱可從IBL定夠（編號：KEME761） |
| 3× | FOIL | 粘性金屬板 |
7、實驗所需器材但試劑盒不提供
1）移液器，體積：50; 500ul
2）試管（12×75mm）
3）軌道振蕩器（400-600rpm）
4）旋渦混合器
5）帶儲器的8道移液器
6）洗滌瓶，自動或半自動洗板機
7）離心機（冷凍離心機更適宜）：200-500×g，也可選用多頭抽真空裝置（例如：Mallinekrodt-Baker 或Waters）。
8）甲醇（HPLC級）
9）蒸發離心機
10） 可在405nm處讀數的酶標儀（參考波長600-650nm）
11） 蒸餾水或去離子水
12） 吸水紙、取樣吸頭和計時器
8、實驗前的準備說明
| 注意 | 用于96人份檢測色試劑盒成分可分成3次進行。下列所述體積為檢測32人份時所需要的量。 |
8.1凍干或濃縮成分的準備
| 稀釋/溶解 | 成分 |
| 稀釋劑 | 比例 | 備注 | 儲存 | 穩定性 |
| 15ml | 檢測緩沖液 | 150ml | 雙蒸水 | 1：10 |
| 2-8℃ | 4周 |
|
| 標準品和質控品 | 2.0ml | 雙蒸水 |
| 靜置15min，混合時避免氣泡 | ≤-20℃ | 直至有效期 |
|
| 褪黑激素生物素 | 2.0ml | 蒸餾水 |
| 靜置15min，混合時避免氣泡 | 臨時配置,只能使用一次 | |
|
| 褪黑激素抗血清 | 2.0ml | 蒸餾水 |
| 靜置15min，混合時避免氣泡 | ||
| 70ul | 酶聯物 | 5.6ml | 已稀釋的檢測緩沖液 | 1:81 |
| ||
| 3 | PNPP底物片 | 8ml | PNPP底物緩沖液 |
|
| ||
| 10ml | 未稀釋甲醇 | 100ml | 蒸餾水 | 10%（v/v） |
| ||
如果溶液的需要量比較大,應該將試管內的溶液混合.避免反復凍融。
8.2樣品的稀釋
如果懷疑樣品中的褪黑激素濃度比zui高標準品的高，必須將樣品在提取步驟前用檢測緩沖液進行進一步的稀釋。
8.3樣品、標準品和質控品的提取（提取柱）
按照此步驟進行提取，提取量大約為90-100%。
為了避免柱子堵塞，提取樣品前將樣品過濾或離心一下。
| 注意 | 每份樣品、標準品和質控品都必須提取，提取必須提前進行。干燥的提取物（甲醇蒸發后）可在2-8℃或-20℃下儲存24個小時。 用甲醇洗提后，提取柱就可以用于下一份樣品的提取或是存放到2-8℃的環境下。提取柱可以反復使用4次。如果是重復使用，在再次從A.1開始（柱的調制）。 |
A、標準版本：離心與蒸發離心步驟
1.柱的調制
| 1 | 將提取柱放到聚苯乙烯或玻璃試管中（12×75mm）。 |
| 2 | 在提取柱中加入2×1ml的甲醇（未稀釋的），200g離心1min使溶劑通過提取柱，棄取洗出液。 |
| 3 | 向提取柱中加入2×1ml的蒸餾水，200g離心1min使溶劑通過提取柱，棄取洗出液。 |
| 4 | 為了避免柱子變干，請立即提取樣品。 |
2.樣品提取
| 5 | 將提取柱放到相應的標記聚苯乙烯或玻璃試管中（12×75mm）。 |
| 6 | 向提取柱中加入0.5ml標準品、質控品和樣品，200g離心1min使溶劑通過提取柱，棄取洗出液。 |
3、洗滌
| 7 | 向提取柱中加入2×1ml的10%甲醇（蒸餾水稀釋），500g離心1min使溶劑通過提取柱，棄取洗出液。 |
4、提取物的洗脫
| 8 | 將提取柱放到新的標記聚苯乙烯或玻璃試管中（12×75mm） |
| 9 | 向提取柱中加入1ml未稀釋的甲醇，200g離心1min使溶劑通過提取柱。 |
| 10 | 將提取柱從試管中移出，避免液滴還停留在柱子中。將柱子用于下一份樣品的提取或存放于2-8℃的環境下。提取柱可重復使用四次。 |
5.提取物的蒸發和重新配置
| 11 | 用蒸發離心機將甲醇蒸發掉。 |
| 12 | 用0.15ml的蒸餾水重新稀釋配置樣品 |
| 13 | 旋渦混和1分鐘，并立即檢測樣品。 |
B、選擇性版本：用多頭抽真空裝置代替離心機
| 提取步驟仍然按照A1-5進行，柱子不變。 用真空和≤5ml/min的流速使溶劑通過柱子。 樣品和提取物用≤2ml/min的流速。 用蒸發離心機或氮氣蒸發干燥溶劑。 |
9、實驗步驟
| 1 | 將提取好的標準品、質控品和樣品分別50ul加入到相應的微孔中。 |
| 2 | 在每一微孔中加入50ul褪黑激素生物素。 |
| 3 | 在每一微孔內加入50ul褪黑激素抗血清。 |
| 4 | 蓋板，輕輕震板，2-8℃下溫育14-20小時。 |
| 5 | 移去粘性金屬板，棄取孔內反應液，每孔用250ul稀釋好的檢測緩沖液洗板3次，吸水紙上拍干以除出殘余液體。 |
| 6 | 在每一微孔中加入150ul臨時配置好的酶聯物。 |
| 7 | 蓋板，室溫（18-25℃）軌道振蕩器上（500rpm）溫育120min。 |
| 8 | 大約在溫育結束10分鐘前準備好PNPP底物液。 |
| 9 | 移去粘性金屬板，棄取孔內反應液，每孔用250ul稀釋好的檢測緩沖液洗板3次，吸水紙上拍干以除出殘余液體。 |
| 10 | 如果有8道移液器，請用8道移液器加底物液和終止液，加底物液和終止液的時間間隔應當相同。使用主動置換型移液器并避免氣泡產生。 |
| 11 | 在每一微孔中加入200ul臨時配置好的PNPP底物液。 |
| 12 | 室溫（18-25℃）軌道振蕩器上（500rpm）溫育20-40min。 |
| 13 | 在每一微孔中加入50ul PNPP終止液，輕輕震板以使溶液混合均勻。 |
| 14 | 加終止液后60min內在405nm處讀取OD值。（參考波長：600-650nm） |
10、結果計算
在半對數坐標紙上或自動計算的方法，以標準品的OD值（Y軸，線性）對其濃度（X軸，對數）做一條標準曲線。使用三次回歸、四參數或雙對數曲線方程可以得到更好的標準曲線。在推算標準曲線時，應當充分利用好每一個標準品數值（明顯逸出的數值應當被忽略，再使用更加合理的數值代替它）。樣品的濃度可以從標準曲線上直接讀取。從坐標紙上讀取結果時應當把起始的稀釋倍數考慮進去。將稀釋了的樣品結果乘以稀釋因子即可得到其相應的結果。樣品中抗體濃度高于zui高標準品的樣品，應當按實驗前準備說明所述的方法進行稀釋，并重新檢測。
轉換系數：褪黑激素（pg/ml）×4.30=pmol/l
典型標準曲線
（例子：不能用來定量
| 標準品 | 褪黑激素（pg/ml） | 平均OD值 | OD/ODmax（%） |
| A | 0.0 | 1.517 | 100 |
| B | 3.0 | 1.383 | 91.1 |
| C | 10 | 1.214 | 80.1 |
| D | 30 | 0.867 | 57.1 |
| E | 100 | 0.434 | 28.6 |
| F | 300 | 0.260 | 17.1 |
11、期望值
實驗結果不能當作確定治療結果的*因素，疾病的判斷還應當與其它臨床觀察和診斷檢測相結合。對明顯健康的一組人群進行研究發現，人體內的褪黑激素水平有著明顯的生理周期變化，褪黑激素白天的水平很低，而晚上的水平則很高，而且個體之間的差異也很大。此外，褪黑激素的水平也與年齡有關系，其zui高濃度是在嬰兒（3歲）樣品中發現的。對6個明顯健康獻血者的褪黑激素生理周期進行研究。褪黑激素大概在白天下午四點zui低，其平均值是4.6pg/ml；早晨4點達到，平均值為77.5pg/ml。健康個體之間的褪黑激素zui高值差異很大，建議每個實驗室都確定自己實驗室的正常值范圍。
本譯文僅供參考，詳情請以原文為準。
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