HPL人胎盤泌乳素ELISA試劑盒

美國DRG*，貨號：EIA1283

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DRG公司的HPL（人胎盤泌乳素）ELISA試劑盒可用于人血清中HPL的定量檢測。此試劑盒僅供體外診斷用。

HPL的是生理學(xué)功能到目前為止還未確定，但它很大程度上與人生長激素一樣是孕期胎兒胎盤和生理變化的調(diào)節(jié)者，這表明母體血清HPL的水平可以放映胎盤的功能。

在（胎兒）宮內(nèi)死亡、嬰兒分娩疼痛和生產(chǎn)時胎兒窒息的病例中，其人胎盤泌乳素（HPL）水平會降低。如果HPL的低水平重復(fù)出現(xiàn)，那么這種相關(guān)性就特別明顯，它表明子宮長期處于這種狀態(tài)就會使胎兒受到損害。如果孕期正常，母體HPL水平降低（的情況）一般不會出現(xiàn)。在單胎妊娠中，如果HPL水平升高則意味著*的妊娠結(jié)果。然而高水平的HPL也有可能意味著嬰兒潛在某些特定疾病，如糖尿病嬰兒先天肥胖性巨體、新生兒溶血癥和胎兒水腫病的重要病理學(xué)原因。

   DRG公司的HPL酶免實驗是一種基于夾心法原理的固相酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）。反應(yīng)板上的微檢測孔包被有能結(jié)合HPL分子上*抗原位點的單克隆抗體。一份含有內(nèi)源性HPL的病人樣本在包被孔中與酶聯(lián)物進(jìn)行孵育，該酶聯(lián)物是一種聯(lián)結(jié)有辣根過氧化物酶的抗HPL抗血清。孵育后，用洗滌液洗去未結(jié)合的酶聯(lián)物。辣根過氧化物酶的結(jié)合總量與樣本中HPL的濃度成正相關(guān)。加入底物溶液后，顯出的顏色強度與病人樣品中HPL的濃度成正比。

1）       微孔反應(yīng)板，可拆，12×8（96孔），包被有抗HPL的單克隆抗體。

2）       標(biāo)準(zhǔn)品（標(biāo)準(zhǔn)品1-4），4支，0.5ml，待用。濃度：1.25；5.0；10.0；20mg/L，轉(zhuǎn)換系數(shù)：1mg/L=1mIU/L。內(nèi)含0.3%的Proclin防腐劑。

3）       零標(biāo)準(zhǔn)品（也用做樣品稀釋液），1支，90ml，待用，0mg/L。內(nèi)含0.3%的Proclin防腐劑。

4）       酶聯(lián)物，1支，11ml，聯(lián)結(jié)有辣根過氧化物酶的抗HPL 抗體。內(nèi)含0.3%的Proclin防腐劑。

5）       底物溶液，1支，11ml，待用，TMB（四甲基聯(lián)苯胺）

6）       終止液，1支，6ml ，內(nèi)含0.5M的H2SO4。請不要接觸終止液，以免刺激皮膚和著燒。         

   未開啟的試劑在2—8℃下貯存，在有效期內(nèi)可以保持活性。不要使用過期試劑。酶聯(lián)物、底物溶液、標(biāo)準(zhǔn)品和零標(biāo)準(zhǔn)品必須在2—8℃下貯存。

   微孔反應(yīng)板必須在2—8℃下貯存。一旦包裝袋被打開，必須將它小心地嚴(yán)封起來。拆開包裝后，包被的微孔反應(yīng)板的免疫活性可在約6周內(nèi)保持穩(wěn)定，但必須密封在裝有干燥劑的袋子里。

1）       酶標(biāo)儀 （450±10nm）（如DRG 公司的酶標(biāo)儀）

2）       配有一次性使用的10μl、50μl、100μl和1000μl吸嘴的取樣槍

3）       吸水紙。

4）       蒸餾水

5）       用于樣品稀釋的試管（12×75mm）。

血清將會在此實驗中用到。不要使用易溶血、黃疸血或脂血樣品。注意：含疊氮鈉的樣品不可用于此實驗。

1）       樣品的采集：血清，靜脈穿刺采集全血，待其凝血，在室溫下用離心機分離血清。未*凝血前請勿離心，接受了抗凝劑治療的病人樣品可能需要更長的凝血時間。

2）       樣品的儲存：必須蓋住樣本并在實驗之前于２-８℃下可貯存至５天。樣品需要更長的貯存時間，必須在實驗之前于-20℃下一次性凍存。融化的樣本在檢測之前必須要上下倒置幾次。

3）       樣品的稀釋：實驗開始前，用零標(biāo)準(zhǔn)品按1：100的比例稀釋樣品。首先在每一樣品試管中加入1ml零標(biāo)準(zhǔn)品，再向相應(yīng)的試管中加入10μL樣品，把所有的試管在旋渦混合器上混合10秒（避免氣泡）

4）       在實驗中，樣品中HPL濃度高于zui高標(biāo)準(zhǔn)品的必須用零標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行進(jìn)一步的稀釋。在計算樣品濃度時就應(yīng)當(dāng)把此稀釋因子考慮進(jìn)去。

1）       所有試劑和樣本在使用之前必須平衡至室溫。所有試劑必須搖勻但不能起泡沫。

2）       一旦檢測開始，所有的操作步驟必須進(jìn)行到底不能中斷。

3）       為了避免交叉放映，每一標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和樣品的取樣都必須使用新的取樣吸頭。

4）       吸光度值是由孵育的時間和溫度所決定的。在實驗開始之前，建議準(zhǔn)備好所有的藥劑旋開蓋子。

將所需檢測的微孔板條固定在板架上等。這些準(zhǔn)備工作將確保每次的加液步驟所需時間相同，沒有中斷。

5）       按一般的規(guī)律，酶免反應(yīng)的強度與時間和溫度成線性比例。

1）       手工加樣：建議每次實驗做不超過32個檢測孔。或者，建議在三分鐘內(nèi)加完所有的標(biāo)準(zhǔn)品、樣品和質(zhì)控品。

2）       自動加樣：每次實驗可做整板96個檢測孔。或者，建議在三分鐘內(nèi)加完所有的標(biāo)準(zhǔn)品、樣品和質(zhì)控品。

3）       所有的標(biāo)準(zhǔn)品、樣品和質(zhì)控品都必須同時做雙份，以保證所有的檢測條件都一樣。每次檢測都必須有一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1）       將所需數(shù)量的板條固定到板架上。

2）       將標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和已稀釋好的樣品分別用新的取樣吸頭取10μL加入到相應(yīng)的微孔中。

3）       在每一微孔中加入100μL酶聯(lián)物。

4）       充分混勻10秒，在這個步驟*混勻很重要。

5）       室溫孵育30分種。

6）       快速棄取孔內(nèi)反應(yīng)物，每孔用400μL蒸餾水洗板5次，在吸水紙上拍干。注意：洗板步驟是否正確操作會明顯影響實驗的靈敏度和度。

7）       在每一微孔中加入100μl底物。

8）       室溫孵育10分種。

9）       加50μl終止液到每個檢測孔中終止酶反應(yīng)。

10）   加終止液后10分鐘之內(nèi)，用酶標(biāo)儀在450±10nm處測定OD 值。

1）       計算每個標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和病人樣本的平均吸光度值。

2）       用吸光度值作為縱坐標(biāo)（y），濃度值作為橫坐標(biāo)（x），以每個標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值對其相應(yīng)的濃度值進(jìn)行標(biāo)繪，作一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3）       用每一樣品的平均吸光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上確定其相應(yīng)的濃度。

4）       自動計算方法：IFU上的結(jié)果是用四參數(shù)曲線已自動計算得到的。其它的歸納方法可能會得出稍微不同的結(jié)果。

5）       樣品的濃度可直接從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取。樣品中HPL濃度高于zui高標(biāo)準(zhǔn)品的必須用進(jìn)行進(jìn)一步的稀釋。在計算樣品濃度時就應(yīng)當(dāng)把此稀釋因子考慮進(jìn)去。

強烈建議每個實驗室都建立自己實驗室的正常和不正常值。在一次研究中，我們用DRG公司的hPL ELISA進(jìn)行檢測，得到如下結(jié)果：

 

 

１．              特異性

     用來檢測的抗原                                    與HPL等價

人絨毛膜促性腺激素          2000IU/ L              檢測不出

催乳激素                                     200μg/L                          檢測不出

     甲胎蛋白                   300KIU/L                檢測不出

 人生長激素                 100μg/L                檢測不出

２．              靈敏度

用本實驗方法測得的HPLzui小濃度值為0.043 mg/L。

３．              度

a.            批內(nèi)差實驗度

該度是由在一實驗當(dāng)中對3個不同質(zhì)控品的重復(fù)測定來決定的。批內(nèi)差異羅列如下：

b.            批間差實驗度

該度是由在幾次實驗當(dāng)中對3個不同質(zhì)控品的重復(fù)測定來決定的。批間差異羅列如下：

４．              重復(fù)性和線性

a.            重復(fù)性

不同的已知HPL水平的病人血清樣本混合起來并做雙份實驗。平均重復(fù)率為101.17%。

期待濃度值（mg/L）        測得的濃度值（mg/L）           重復(fù)率（%）

 

b.            線性

    在線性研究中，用零標(biāo)準(zhǔn)品對兩個病人樣本進(jìn)行一系列的稀釋。平均重復(fù)率為99.7%。

病人樣本號     稀釋度   期待濃度值（mg/L）  測得的濃度值（mg/L）        重復(fù)率（%）

５．              Hook’s效應(yīng)

本實驗中，HPL濃度值達(dá)到700mg/L仍未產(chǎn)生Hook’s效應(yīng)。

l        質(zhì)量控制

良好的實驗操作要求每次用校準(zhǔn)曲線來做質(zhì)控品。測定一批具有統(tǒng)計學(xué)意義數(shù)量的質(zhì)控品，來建立平均值和正常人的濃度值范圍以確保合適的實驗操作。不應(yīng)使用含有疊氮化物的質(zhì)控品。

l        產(chǎn)品限制

1）       做實驗時要對包裝內(nèi)說明書有充分的理解并具有良好的實驗操作，這樣會獲得可靠得和可重復(fù)   的結(jié)果。

2）       使用本試劑盒得到的結(jié)果應(yīng)該僅作為其它診斷程序的一個幫助和為內(nèi)科醫(yī)生提供有用的信息。

3）       沖洗步驟很關(guān)鍵。沖洗不充分會導(dǎo)致度低并使光度值讀數(shù)偏高。

 

本譯文僅供參考，詳情請以原文為準(zhǔn)。

 

 

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