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內皮素-1（一種21個氨基酸分子組成的多肽）是目前所知的zui有效的血管收縮劑。1985年Rubanyi研究小組發(fā)現(xiàn)了一種多肽并將其命名為內皮源性收縮因子（EDCF），之后Yanagisawa將其分離、測序、克隆，并命名為內皮素，而且認為它是zui有效的血管收縮劑，這使得人們了解到它更多的生理功能。內皮素-1（ET-1）是哺乳動物三種血管活性肽家族中的一種，這三種血管活性肽還包括內皮素-2和內皮素-3。這兩種相關多肽的2和6號位的氨基酸與ET-1的不同。這些基因可以產(chǎn)生三種前肽，之后可分解成三個含39個氨基酸分子的內皮素分子。我們可以獲得一系列內皮素多肽和前肽家族的功能概述和分子生物學知識。ET-1對平滑肌細胞、成纖維細胞有強烈效應，并且它也參與很多疾病過程，特別是心血管疾病。ET-1在充血性心力衰竭、腎衰竭和肺動脈高血壓中有重要作用。人的ET-1和牛、犬、鼠、豬、兔和大鼠的ET-1有相同的氨基酸序列。

此試劑盒是一種夾心法的ELISA試劑盒，整個試劑盒使用了兩種高特異性的抗體。TMB作為顯色劑，zui終溶液所顯示的顏色強度與樣品中ET-1的量成正比。測量范圍：0.78～100pg/ml

IBL的ET-1 ELISA試劑盒可用于人血清、EDTA血漿、細胞培養(yǎng)液上清和組織提取液中ET-1的定量檢測。

1）  包被板：微孔用抗ET^15-21兔IgG包被，96孔。

2）  濃縮型酶標抗體：HRP標記的抗ET-1兔IgG Fab片段，30倍濃縮，0.4ml。

3）  標準品：ET-1，0.5ml×2。

4）  EIA緩沖液：內含1%的BSA、0.05%的吐溫20的PBS緩沖液，30ml。

5）  用于稀釋酶標抗體的稀釋液：內含的1%BSA、0.05%的吐溫20的PBS緩沖液，12ml。

6）  顯色劑：TMB底物液，15ml。

7）  終止液：1N的H2SO4，12ml。

8）  濃縮洗滌液：內含0.05%吐溫的磷酸緩沖液（40倍濃縮），50ml。

1）  酶標儀（450nm）

2）  微量移液器和取樣吸頭

3）  帶刻度的量筒與燒杯

4）  蒸餾水

5）  溫育器（37℃±1℃）

6）  冷床箱（4℃）

7）  坐標紙（log/log）

8）  吸水紙

9）  用于稀釋標準品的試管

10）              洗滌瓶

11）              酶標抗體稀釋的一次性試管

12）              提取用的Sep-Pak C-18柱和試劑，見“樣品處理應注意的問題”

1）  洗滌液的準備：洗滌液是一種40倍濃縮的緩沖液，使用前應當將洗滌液平衡至室溫，并混合均勻。用1950ml蒸餾水稀釋50ml濃縮洗滌液，混合均勻，這就是即用型的洗滌液。稀釋后的洗滌液應當儲存于冰箱中至2周

2）  酶標抗體的準備：標記抗體是30倍濃縮的，根據(jù)實驗所需要的量，用酶標抗體稀釋液將濃縮酶標抗體稀釋30倍，稀釋后就可以用了。例如：如果您檢測8孔，則需要800ul即用型的酶標抗體（用870ul酶標抗體稀釋液稀釋30ul濃縮的酶標抗體，并混合均勻，使用時每孔加100ul）。酶標抗體應當在使用前臨時將其準備好。剩余的濃縮酶標抗體應當密封儲存于4℃的環(huán)境下。

3）  標準品的準備：在試管內，用0.5ml蒸餾水稀釋標準品，并混合均勻，稀釋后ET-1標準品的濃度為200pg/ml。

4）  標準品的稀釋：為標準品稀釋準備9個試管，在每個試管中加入230ul EIA緩沖液。每支試管的具體濃度如下：

將230ul標準品溶液加入到試管1中，混合均勻；之后將230ul試管1中的溶液加入到試管2中，將標準品連續(xù)兩倍稀釋來確定8點標準品（濃度為100pg/ml到0.78pg/ml），EIA緩沖是檢測樣品空白對照，濃度為0pg/ml。

如圖：

 

5）  檢測樣品的稀釋：如果有必要稀釋的話，用EIA緩沖液稀釋檢測樣品。如果您要用血清、血漿或組織樣做樣品，有必要用Sep-Pak C-18提取柱進行預提取。（見 “樣品處理應注意的問題”）

在實驗開始大約30分鐘時，將所有的試劑都平衡至室溫。輕輕的并充分混勻試劑。確保所有試劑都未變質。標準曲線的準備應當與樣品的檢測同時進行。

1）  確定好空白孔，并在相應的微孔中加入100ul EIA緩沖液。

2）  確定好樣品對照孔，檢測樣品孔和標準品孔，然后分別將100ul樣品對照品、檢測樣品和稀釋好的標準品加入到相應的微孔中。

3）  蓋板，4℃下溫育一整夜

4）  用洗滌瓶洗板，在微孔中加入洗滌液再浸泡15-30秒，棄取洗滌液。重復7次，zui后在吸水紙上拍干。如果是用洗板機洗板時，用洗板機洗四次后，再用洗滌瓶洗3次。

5）  每一微孔中加入100ul酶標抗體。

6）  蓋板，37℃下溫育30min

7）  按照步驟4）洗板9次

8）  將所需量的顯色劑加入到試管中，然后每孔內加入100ul顯色劑。為了避免污染，請勿將剩余試劑在倒入顯色劑原裝瓶中。

9）  室溫避光溫育30min，加入顯色劑后溶液顏色會變成藍色

10）              在每一微孔中加入100ul終止液，此時溶液顏色會變成黃色。

11）              移去包被孔底的雜質或水滴，同時確保液體表面無泡沫， 30min內在450處讀取OD值。

1.     樣品采集后應立即檢測，如需貯存的，則應放置在冰凍條件下，避免反復凍融，檢測前應在低溫下將其溶解并*混合

2.     如有需要，樣品可用EIA緩沖液稀釋

3.     建議試驗樣品和標準品做雙份檢測

4.     試驗樣品應在中性PH范圍內，有機溶劑的污染會影響試驗

5.     只能使用試劑盒內提供的洗滌液洗板，洗板不充足可能會導致試驗失敗

6.     *倒去洗滌液，吸水紙上拍干，不能用吸水紙擦拭微孔

7.     底物液應避光保存，因其對光敏感，且要避免接觸金屬

8.     加入終止液后30min內讀數(shù)

繪制標準曲線前，將所有的檢測孔（包括標準品和未知樣品）的OD值都減去檢測樣品空白孔的OD值。在對數(shù)坐標紙上，以標準品的OD值（減去空白后的值）對其相應的濃度，通過這些點作一條平滑的標準曲線。我們可以從標準曲線上讀取未知樣品的濃度值。

典型標準曲線

 

 

附：采用全自動酶標儀檢測，只需檢測前設置好酶標儀的相關參數(shù)，如坐標參數(shù)（線性，半對數(shù)）和計算方式參數(shù)（三次回歸、四參數(shù)或雙對數(shù)曲線方程），即可直接得到結果

 

直接用于檢測的樣品所含蛋白濃度低（如細胞培養(yǎng)液上清，尿液等），但是，抽提物中要求高濃度蛋白（如血漿，血清，組織勻漿等），樣品抽提建議采用Sep-Pak C-18柱：

1. Sep-Pak C-18柱預處理^（1）

a. 4ml純乙醇沖洗

b. 2ml的去離子水沖洗2次

c. 2ml 0.1%的TFA液沖洗2次

2.樣品預處理

a. 血漿（血清）-6ml 10%乙酸與2ml血漿混合

b. 組織樣品

（1）組織樣品和勻漿內加入1M的乙酸和20mM鹽酸溶液

（2）煮沸10min后，10000rpm下離心10min，收集上清

3. 樣品抽提

a. 樣品加入至Sep-Pak C-18柱

b. 3ml去離子水洗柱3次

c. 用合適的溶液^（2）洗柱收集2ml樣品至瓶內

4. 檢測

采集的樣品應凍干和凍存，貯存的樣品用0.1ml的溶液^（3）和0.2ml的EIA緩沖液混合，確保樣品PH在中性范圍內。樣品間的回收率存在不同，請?zhí)崆白龌厥赵囼?/div>