25-OH 維他命D（總）檢測試劑盒（酶聯免疫法）
（德國DRG*，貨號：EIA5396）
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預期用途
此試劑盒用于血清和血漿中總25羥基維他命D（維他命D2和維他命D3）的檢測
 
實驗原理
此試劑盒基于競爭酶聯免疫法
首先，由于體內多數循環25-OH VD 束縛于VDBP，因此結合樣本需先經過變性緩沖液的預處理來提取分析物；中和反應后，生物素化的25-OH VD（酶聯物）與過氧化物酶標記的鏈霉親和素加入，混勻，加入微孔板內，樣本中的內源性25-OH VD與25-OH VD-生物素酶聯物競爭結合包被板上包被的VDBP，結合的生物素化的25-OH VD由過氧化物酶標記的鏈霉親和素檢測，孵育，洗板，除去未結合的成分，加入底物液發生顏色反應，一定的時間后加入終止液；顏色強度與樣本中的25-OH VD濃度成反比
 
注意事項
 

1. 此試劑盒僅供研究及專業人士使用
2. 試劑盒內所有含有人血清或血漿的試劑都經FDA批準進行了檢測，HIV I/II, HBsAg 和HCV都呈陰性；但在使用及處理時還應視潛在生物危險物質
3. 實驗前，詳細閱讀完說明書。使用試劑盒內提供的有效版本說明書，確保理解所有操作步驟

4. 包被板條為可分拆板條。未使用的微孔板放入密封的小袋中，置于2℃- 8℃下存儲
5. 按相同的順序迅速加樣品和試劑
6. 每種不同試劑都用單獨的容器盛放，特別是底物液。將底物液盛放在曾經保存過酶聯物的容器中，會導致變色。切勿將試劑倒回小瓶中，避免污染
7. 為得到*結果，充分混勻微孔中的溶液。別重復使用包被板
8. 實驗過程別讓微孔靜置干燥。各步驟加試劑后，應充分洗板
9. 實驗前，將所有試劑平衡至室溫（21℃－26℃）。溫度會影響實驗讀數，然而，樣品的測量濃度值不受影響
10. 切勿用嘴移液,避免皮膚和黏膜接觸試劑和樣品
11. 別在樣品和試劑處理實驗區吸煙，飲食和化妝
12. 處理樣品和試劑時,請戴一次性手套.微生物感染的試劑盒樣本會導致錯誤的實驗結果.
13. 根據相關國家生物有害物質安全條例或規范操作
14. 別使用過期的試劑, 有效期見標簽
15. 嚴格依據說明書要求，所有試劑的加樣量準確。只有使用標準移液管和標準酶標儀才能得到*結果
16. 不要將不同批次的試劑混合使用，也不建議將同一批次的板條進行互換，試劑盒裝運或儲存的環境不一樣也會導致結果有微小的不同
17. 避免接觸酸性終止液（0.5 M硫酸），以免灼傷和刺激皮膚
18. 有些試劑盒含Proclin 300, BND或MIT作為防腐劑。如不慎接觸眼睛或皮膚，用大量清水沖洗
19. TMB底物液對皮膚和粘膜有刺激作用。如不慎接觸眼睛，用大量的清水沖洗，如不慎接觸皮膚，用香皂和清水清洗。如不慎吸入，帶傷者至空氣流通的地方
20. 化學物質和試劑盒必須根據相關國家生物有害物質安全條例或規范進行處理
21. 有關生物危害的詳細信息見物料安全數據單, 物料安全數據單可直接向DRG公司獲取
試劑盒組成
 

1. 包被板，96孔，可拆，包被了維他命D結合蛋白（VDBP）
2. 標準品（0-5），6瓶，1ml，即用，濃度：0-4-10-25-60-130pg/ml；轉換：1 ng/mL = 2.5 nmol/L.標準品根據NIST SRM校準；含無汞防腐劑
3. 高低質控，2瓶，1ml，即用，質控品具體數值及范圍見QC指控單，含無汞防腐劑
4. 變性緩沖液，1瓶，10ml，即用
5. 中和緩沖液，1瓶，25ml，即用，含無汞防腐劑
6. 酶聯物，1瓶，7ml，即用，生物素化維他命D3，含無汞防腐劑
7. 酶聯混合物，1瓶，7ml，即用，鏈霉親和素-過氧化物酶，含無汞防腐劑
8. 底物液，1瓶，25ml，即用，TMB
9. 終止液，1瓶，14ml，即用，含0.5M的硫酸
10. 洗滌液，1瓶，30ml，40倍濃縮
11. 蓋板，1塊

注意：根據需要可額外訂購樣本稀釋用的零標準品
 
實驗所需材料但試劑盒未提供
 

1. 用于維他命D釋放的玻璃瓶
2. 孵箱37℃
3. 酶標儀（450±10nm）
4. 校準的移液器
5. 吸水紙
6. 去離子水或雙蒸水
7. 計時器
8. 半對數坐標紙或數據處理軟件

 
貯存條件
未開封的試劑在2-8℃下可保存至有效期，不要使用過期的試劑
開封的試劑和包被板必須貯存于2-8℃，密封袋一旦打開后，應立即密封好
開封的試劑盒若按上述方法保存可保持2個月的活性
 
試劑準備
實驗前將所有試劑和試驗所需板條平衡至室溫
洗滌液
30ml的濃縮洗滌液+1170ml的去離子水混勻，得到1200ml的即用型洗滌液，稀釋的洗滌液可在室溫下保存2周
 
試劑盒處理
根據相關國家規范處理廢棄試劑盒. 試劑盒的特別信息見物料安全數據單
 
損壞的試劑盒
萬一試劑盒或試劑成分受到損壞,收到試劑盒zui遲1周以書面形式通知DRG. ，嚴重受損的試劑組分不能用于實驗.
保存受損試劑組分,直至找到好的解決方法. 根據*規范處理損壞組分.
 
樣本
此次試驗采用血清或血漿（EDTA;肝素；檸檬酸鹽血漿）樣本
不要使用溶血，脂血，黃疸血樣本
注意:不要使用含有疊氮化物的樣本
 
樣本采集
血清
靜脈采血采集全血，立即凝集，室溫下離心分離出血清；樣本未*凝集前不能離心；接受抗凝劑治療的病人可能需要更長的凝集時間
血漿
將全血采集至含有抗凝劑的采血管內，離心便可
 
樣本貯存和準備
樣本采集后蓋好蓋子，2-8℃下可保存3天；若要保存更長時間，則需凍存于-20℃；避免反復凍融
 
樣本稀釋
初次試驗中，若出現樣本的濃度值高于zui高標準，則需將樣本進行進一步的稀釋，并重新檢測，zui終結果應乘以相關的稀釋因子
例如：
A）1:10稀釋           10ul的血清+90ul的零標準品（充分混合）
B）1:100稀釋               10ul  A）1:10稀釋的+90ul的零標準品（充分混合）
 
實驗步驟
一般注意事項
–使用前，將所有的樣品和試劑平衡至室溫。試劑混勻，避免產生氣泡
–實驗開始后，所有步驟應無中斷連續進行下去
–使用新的一次性加樣槍頭，加標準品，質控品，樣品，避免交叉污染
–吸光度值是受孵育時間和溫度影響。實驗前，請準備好所有的試劑，打開瓶蓋，保證所需包被板條置于板架上確保所有的加樣時間間隔相等，無間斷
–一般情況，酶反應與時間和溫度成線性相關
 
試驗操作
每次實驗都應建立標準曲線
所有標準品，樣本和質控都做雙孔檢測；所有的標準品，樣本和質控都在同一時間內操作，確保實驗環境一致
 
樣本預處理步驟
 

1. 將試驗所需的玻璃瓶或未包被的包被板固定好
2. 每玻璃瓶加25ul的標準品，質控和樣本，每次加樣更換新槍頭
3. 每玻璃瓶加50ul的變性緩沖液
4. 蓋上蓋子，37℃下孵育30min
5. 每玻璃瓶加200ul的中和緩沖液
6. 每玻璃瓶加50ul的酶聯物
7. 每玻璃瓶加50ul的酶聯物混合物
8. 充分混合10秒，充分混合這一步相當重要；然后吸取200ul 此混合溶液用于ELISA試驗

 
ELISA 步驟
 

1. 將實驗所需板條固定于板架上
2. 加200ul上述已預處理的標準品，質控品和樣本于相應的微孔內
3. 蓋板，37℃下孵育60min
4. 棄去孔內反應液，每孔加300ul的洗滌液洗板4次，吸水紙上拍干

  注意：試驗的靈敏度和度與洗板是否*緊密相關
 

1. 每孔加200ul的底物液
2. 室溫下孵育15min
3. 每孔加100ul的終止液
4. 加完終止液后10min內在酶標儀450±10nm處讀數

 
結果計算
 

1. 計算各標準品，質控品和樣本的吸收值均值
2. 在半對數坐標紙或線性坐標紙上以標準品的濃度為X軸，吸收值為Y軸，繪制標準曲線
3. 以樣本的吸收值可從標準曲線上得到相應的濃度值
4. 自動計算方法：說明書中的標準曲線是通過4參數邏輯函數法計算得到，4PL是*方法，其他的方法可能會有些許的偏差
5. 樣本濃度可直接從標準曲線上讀取；若樣本濃度值高于zui高標準品，則需進一步稀釋重新檢測或結果記錄為＞130ng/mL；zui終結果計算時應乘以相關的稀釋因子

 
本譯文僅供參考，請以原說明書為準
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