人胎球蛋白A檢測試劑盒（酶聯免疫法）
德國DRG*，貨號：EIA4522
德國DRG中國*代理商“深圳科潤達生物工程有限公司”竭誠為您服務

 
預期用途
此試劑盒可用于血清，血漿，細胞上清，組織提取物和尿液中人胎球蛋白A也稱之為α-2-HS糖蛋白的定量的檢測；血清或血漿中胎球蛋白A的檢測可作為某些癌癥及基因遺傳缺陷的血清蛋白診斷的輔助工具；此試劑盒僅供實驗室專業人士使用
 
簡介
胎球蛋白A也稱之為α-2-HS糖蛋白，是由兩個氨基末端抑制域和一個較小的羧基末端域組成的59 kDa 分子量的糖蛋白；由肝臟合成，分泌至血流，成年哺乳動物體內的濃度范圍在0.5-1.0g/L；嬰兒期的血清胎球蛋白A含量高，參與蛋白酶抑制活性，與鈣代謝和骨生成調節相關；累積于骨和牙齒內，作為生物學上非膠原骨蛋白的主要部分，研究表明，胎球蛋白A是循環中主要的鈣化抑制劑；干涉鈣鹽沉淀；近期研究顯示低水平胎球蛋白A的慢性腎臟衰竭患者與心血管病的高死亡率顯著相關；另一方面，糖尿病老年人血清胎球蛋白A含量比正常人高，這是獨立于胰島素抑制劑的其他標記物；另外，高胎球蛋白A水平還可作為心血管疾病的的危險標記物
 
實驗原理
此試劑盒可用于血清樣本中人胎球蛋白A的定量檢測；采用雙位點夾心法，羊抗人胎球蛋白A多抗結合人胎球蛋白A的不同位點
將含人胎球蛋白A的試驗標準品，質控品和預稀釋樣本加至包被了高度親和羊抗人胎球蛋白A多抗的微孔內，*次孵育，包被抗體捕獲樣本中的人胎球蛋白A，未結合的蛋白洗板除去，然后加入HRP標記的抗人胎球蛋白A酶聯物加入至每孔，“夾心-人胎球蛋白A-HRP-標記的酶聯物”形成夾心，未結合的示蹤抗體通過洗板除去，結合于包被板上的HRP酶免物與底物液定時反應，然后在酶標儀上檢測；結合于包被胎球蛋白A上示蹤抗體酶活性與樣本中胎球蛋白A的含量直接相關，在點對點或三次回歸模式下以標準品的濃度比上OD值繪制標準曲線，樣本中的胎球蛋白A可直接從標準曲線上得到
 
試劑：準備與貯存
此試劑盒收到后立即貯存于2-8℃下，效期見試劑盒標簽；所有成分在2-8℃下可保存至有效期
使用前，所有試劑平衡至室溫，不同批次的試劑不能交換使用
 

1. 包被板，96孔，包被了抗人胎球蛋白A抗體；微孔板固定于板架上，密封于含有干燥劑的鋁箔密封袋內；貯存于2-8℃至有效期
2. 胎球蛋白A示蹤抗體，1瓶，0.6 ml，濃縮，HRP標記的抗人胎球蛋白A示蹤抗體溶于穩定的蛋白基質中；此試劑使用前需用示蹤劑抗體稀釋液進行稀釋；貯存于2-8℃至有效期
3. 示蹤抗體稀釋液，1瓶，11ml，即用，Trizma鹽酸溶于緩沖液；根據實驗步驟用于示蹤抗體稀釋；貯存于2-8℃至有效期
4. 試驗緩沖液，濃縮，1瓶，11ml，含牛血清白蛋白的磷酸緩沖鹽；建議使用前以1:10比例用雙蒸水稀釋（如11 ml濃縮+99 ml的雙蒸水）；貯存于2-8℃至有效期
5. 洗滌液，濃縮，1瓶，20ml，30倍濃縮；試驗前需用580ml的雙蒸水稀釋，混勻；一旦稀釋，不含疊氮化物防腐劑的磷酸緩沖鹽洗滌液會含表面活性劑；稀釋的洗滌液在室溫下可保存至效期
6. HRP底物液；1瓶，12ml，含過氧化氫的TMB底物液；貯存于2-8℃至有效期
7. 終止液，1瓶，12ml，0.5M硫酸，貯存于2-8℃至有效期
8. 胎球蛋白A標準品，5瓶，含胎球蛋白A，不含疊氮化物防腐劑的液態牛血清基質；各標準品濃度見瓶子標簽；3次凍存周期使用后，所有標準品保存至-20℃或更低
9. 胎球蛋白A質控，2瓶，含人胎球蛋白A，不含疊氮化物防腐劑的液態牛血清基質，各質控的濃度范圍見瓶子標簽，3次凍存周期使用后質控保存至-20℃或更低

 
安全注意事項
 

1. 此試劑用于臨床參考實驗室，僅供醫生或實驗室專業人士體外診斷用
2. 若試劑是有潛在感染風險的，試驗操作和處理時應戴手套
3. 避免接觸含TMB，過氧化氫，硫酸的試劑，TM,B會刺激皮膚和粘膜，導致皮膚過敏反應；TMB還可能是致癌物質；皮膚接觸到硫酸會導致嚴重灼傷，不要接觸到眼睛，皮膚，衣服，不要吸入煙霧，一旦接觸，應立即用大量水沖洗至少15min
4. 良好實驗室操作規范

 
實驗所需材料但試劑盒未提供
 

1. 的單通道移液器，10-25-100-1000ul
2. 適于100 ul的可重復用分液器
3. 適于所有體積的一次性槍頭
4. 一次性玻璃管或塑料管12x75mm或13x100mm
5. 帶蓋的一次性塑料瓶；100-1000ml
6. 鋁箔紙
7. 雙蒸水或去離子水
8. 塑料蓋板或聚乙烯薄膜
9. 多通道洗滌瓶或全自動（半自動）洗板系統
10. 酶標儀，450nm

 
樣本采集
人胎球蛋白A的檢測所需血清或血漿樣本量僅10 ul
個人在采樣前無需特殊準備，全血采集，室溫下立即凝集30min，然后離心分離出血清（850-1500 xg 10min）。全血采集3小時內需將血清從凝集中分離出來，轉移至另一干凈試管；血清樣本可保存在-20℃或更低，避免超過三次的凍融
建議采用24小時尿液來檢測尿液中的胎球蛋白A；采集第二天早晨的尿液，排除采樣前剛進行劇烈運動的，因腎功能不全導致多尿的；由利尿藥引起的人體內尿蛋白含量波動降低，可能與尿肌酸酐濃度相關；
細胞上清，組織提取物則需進行試驗樣本的倍比稀釋；多個平行樣檢測得到更的試驗結果
 
實驗步驟
患者樣本的準備
患者血清或血漿樣本在檢測前需用試驗緩沖液進行1:10000 的稀釋
 

1. 以1A和1B 標記兩個試管（12x75 mm）
2. 加1ml的試驗緩沖液至各試管（1A和1B）
3. 加10 ul的患者血清至1A試管，混合（1:100）
4. 從1A管內吸取10ul已稀釋的樣本至1B試管，混合（1:10000）

注意：建議采用/經校準的移液器，稀釋過程小心操作，得到更的結果；建議采用多通道（Combitip）12.5ml的Eppendorf可重復移液器加1ml的試驗緩沖液，而不用50ml的槍頭
 
患者尿液樣本的實驗前用試驗緩沖液1:100的稀釋
 

1. 以1標記一試管（12x75 mm）
2. 各管加1ml試驗緩沖液
3. 加10ul患者尿液樣本至1管，混合（1:100）

注意：若所得結果中樣本濃度高于5個標準品中的zui高標準品濃度，則尿液樣本需進一步稀釋（如1:500），然后重新檢測
 
試劑準備
 

1. 試驗前將所有試劑平衡至室溫，不同批次的試劑不能混合使用
2. 使用前，試驗緩沖液（濃縮）及洗滌液（濃縮）需進行稀釋，配制成工作液；詳情請見“試劑”部分

 
試驗操作
 

1. 將實驗所需板條固定于板架上，標準品，質控品及未知樣本做雙孔檢測
2. 試驗布局

ROW	STRIP 1	STRIP 2	STRIP 3
A	STD 1	STD 5	SAMPLE 2
B	STD 1	STD 5	SAMPLE 2
C	STD 2	C 1	SAMPLE 3
D	STD 2	C 1	SAMPLE 3
E	STD 3	C 2
F	STD 3	C 2
G	STD 4	SAMPLE 1
H	STD 4	SAMPLE 1

1. 加25 ul的標準品，質控品及預稀釋的1:10000樣本至相應孔內；注意：尿液樣本是1:100的稀釋
2. 每孔加100 ul的試驗緩沖液
3. 混勻，蓋板，避免暴露于陽光下
4. 室溫下孵育2小時
5. 示蹤抗體工作液的準備，示蹤抗體1:21的用示蹤抗體稀釋液稀釋；每條板需1ml的示蹤抗體稀釋液+50 ul的胎球蛋白A示蹤抗體
6. 移去蓋板，棄去孔內反應液，每孔加350ul的洗滌工作液洗板5次，然后*吸出孔內液體，或可采用全自動洗板機
7. 以上稀釋的示蹤抗體工作液加100 ul至各孔
8. 蓋板，避免暴露于陽光下
9. 室溫下孵育30min
10. 移去蓋板，棄去孔內反應液，每孔加350ul的洗滌工作液洗板5次，然后*吸出孔內液體，或可采用全自動洗板機
11. 每孔加100 ul的ELISA HRP 底物液
12. 蓋板，避免暴露于陽光下
13. 室溫下孵育20min
14. 移去蓋板，每孔加100 ul的終止液，混勻
15. 10min 內在450nm酶標儀上檢測吸收值

注意：為降低背景色，可以雙波長檢測，設置參考波長：595nm 或620 nm 或630nm
 
操作注意事項
 

1. 建議所有標準品，質控品和未知樣本做雙孔檢測；各雙孔檢測的吸收均值用于數據處理，結果計算
2. 將光敏試劑保持裝于原琥珀色瓶內
3. 將剩余的包被板條放存在含干燥劑的密封袋內，避免受潮
4. 操作嚴格，移液器經校準可確保試驗的可重復性
5. 孵育時間或溫度也可能會影響試驗結果
6. 避免微孔內產生氣泡，可能會導致結合率低，雙孔讀數變異系數高
7. 使用前所有試劑都應*混勻，避免產生氣泡

 
結果說明
 

1. 計算各雙孔吸收值均值
2. 所有的吸收均值都減去標準品1（即0ng/ml）的吸收均值
3. 在點對點或對數-對數坐標紙上以標準品的濃度為X軸，吸收均值為Y軸繪制標準曲線；或是采用數據處理軟件進行結果計算

質控品和樣本濃度（1:10000）可直接從標準曲線上讀取，若采用的是對數-對數或數據處理軟件計算則需用到對數轉換；樣本校正吸收值在濃度1ng/ml 和下一個zui高標準品間的需通過公式計算：

未知樣本濃度=	未知樣本吸收值	x   2nd 標準品濃度值
	2nd 標準品吸光值

 
典型標準曲線
以下為典型示例的吸收值及標準曲線；此標準曲線不能用于其他實驗的計算


期望值
70例正常成人血清檢測人胎球蛋白A ，95%百分比的正常值范圍在0.35-0.95 g/L，均值為0.57 g/L ;標準偏差為0.13 g/L
10000倍的稀釋因子應考慮到樣本濃度的zui終計算
如：從標準曲線上直接得到的10000倍稀釋樣本值是24.3 ng/mL,那原樣本濃度為
24.3 ng/mL x 10,000 = 243000 ng/mL = 0.243 g/L
 
操作局限性
 

1. 人胎球蛋白A直接檢測的zui低濃度為5.0 ng/ml（試驗分析靈敏度），10000倍稀釋的樣本血清回算后，原血清樣本濃度的zui低檢測限是50 ug/ml
2. 因人胎球蛋白A檢測無金標準，所以試驗標準通過稀釋含蛋白基質的高度純化重組人胎球蛋白A建立
3. 可直接讀取的未知樣本濃度高于350 ng/ml，建議對樣本進一步稀釋
4. 若實驗室酶標儀在450nm處的OD值不能超過2.0，建議將標準品6 舍去，不做檢測
5. 細菌或真菌污染的樣本或試劑，或試劑間的交叉污染都可能會導致錯誤結果
6. 聚酯樹脂處理的去離子水不能激活過氧化氫酶

 
質量控制
適當的已知胎球蛋白A水平的質控可確保試驗結果的有效性；建議所有實驗室除了試劑盒本身的質控外，還應額外建立自己實驗室的胎球蛋白A質控
 
性能指標
 

1. 靈敏度

人胎球蛋白A分析靈敏度，零標準品20次重復試驗，95%置信區間，zui后得5.0 ng/ml
 
 

1. 線性

兩個人的血清樣本進行稀釋檢測，結果如下，ng/ml

#	稀釋比例	檢測值	期望值	回收率%
1	1:10,000	21.9
	1:20,000	11.9	11.0	108
	1:40,000	5.3	5.5	96
	1:80,000	2.9	2.7	107
	1:160,000	1.6	1.4	114
2	1:10,000	192
	1:20,000	99.9	96	104
	1:40,000	45.2	48	94
	1:80,000	22.2	24	93
	1:160,000	13.4	12	112

 
 

1. 精密度

兩個樣本在一個試驗中做20次重復檢測，分析板內差異

胎球蛋白A均值（ng/mL）	CV （%）
33.6	5.5
121.1	4.8

 
兩個樣本雙孔檢測，做了12次檢測，分析板間差異

胎球蛋白A均值（ng/mL）	CV （%）
32.4	6.8
123.7	5.7

 
4. 回收率
兩位患者血清加不同量的人胎球蛋白A ，檢測，結果如下，ng/ml

#	原始值	加入的量	檢測值	期望值	回收率%
1	33.6	21	25.1	27.3	92
		63	44.4	48.3	92
		200	120.1	116.8	103
2	121.1	21	68.9	71.1	97
		63	88.6	92.1	96
		200	157.1	160.6	98

 
 
 
 
 
本譯文僅供參考，請以原說明書為準
中國*總代理：深圳市科潤達生物工程有限公司
辦公地址：深圳市南山區蛇口沿山路45號佳利泰大廈7D。
研發地址：深圳市南山區蛇口沿山路10號6樓
：（8線）傳真：+86 755 26814431
免費訂貨：。
技術咨詢：，；手機，；
：518067    ：kerunda@szonline.net。
*：www.kerunda.com.cn
歡迎索取詳細資料，在線：kerunda_tech